Metabolism

Metabolism

Biossíntese de Carboidratos
Processos biosintéticos (anabólicos) produzem as macromoléculas que caracterizam a vida, utilizando energia química provinda da quebra de ATP gerado pelo catabolismo. Iremos discutir aqui os processos pelos quais animais realizam a gliconeogênese, as vias de síntese de carboidratos complexos e a síntese de carboidratos a partir de CO2 e H2O nos organismos fotosintéticos.

A gliconeogênese consiste na síntese de carboidratos a partir de precursores não carboidratos. Em mamíferos, é necessária por causa da exclusividade ou grande preferência de uso de glicose por alguns tecidos como cérebro, hemácias, testículo, medula renal e tecidos embrionários. Em animais, os principais precursores para este processo são lactato, glicerol e a cadeia carbônica de certos aminoácidos. Este processo ocorre no fígado e córtex renal.

As reações da gliconeogênese são as mesmas da glicólise, com exceção dos três passos irreversíveis (com ΔG bastante negativo): a conversão de glicose a glicose 6 fosfato, catalisada pela hexoquinase ou glicoquinase, a fosforilação de frutose 6 fosfato a frutose 1,6 bisfosfato, catalisada pela fosfofrutoquinase I e a conversão de fosfoenolpiruvato em piruvato, pela piruvato quinase. Estes passos são substituídos por processos também irreversíveis na gliconeogênese, permitindo um controle independente dos dois processos.

A conversão do piruvato em fosfoenolpiruvato é o processo que requer a ação de proteínas mitocondriais e citosólicas. Na mitocôndria, o piruvato sofre a ação da piruvato carboxilase, uma enzima dependente de biotina, necessária para fixar HCO3-, levando à formação de oxaloacetato, às custas de ATP. A atividade da piruvato carboxilase é dependente do acúmulo intracelular de acetil-CoA, e esta enzima age tanto na gliconeogênese quanto na reposição de intermediários do ciclo do ácido cítrico.

O oxaloacetato é então reduzido a malato pela malato desidrogenase mitocondrial, oxidando um NADH mitocondrial, numa reversão desta reação em relação a sua função no ciclo do ácido cítrico. O malato é transportado para o citosol, onde regenera oxaloacetato pela ação da malato desidrogenase citosólica, reduzindo um NAD+ citosólico. O resultado final destes processos é o transporte do oxaloacetato e um par de elétrons (na forma de NADH) para o citosol.

O oxaloacetato citosólico é convertido a fosfoenolpiruvato pela fosfoenolpiruvato carboxiquinase, numa reação que requer Mg2+ e utiliza GTP como doador de fosfato. A energia necessária para formar a ligação fosfoenol é provinda tanto da quebra do GTP quando da descarboxilação, e o ΔG global é próximo de zero.

Outra maneira de gerar fosfoenolpiruvato a partir de piruvato é predominante quando o substrato para gliconeogênese é o lactato. O lactato é convertido a piruvato pela lactato desidrogenase, gerando NADH citosólico. Isto permite evitar a necessidade de formar malato, e o piruvato é transportado para a mitocôndria onde gera oxaloacetato que sofre a ação de fosfoenolpiruvato carboxiquinase mitocondrial, gernado fosfoenolpiruvato diretamente, que é transportado para o citosol.

O fosfoenolpiruvato é então convertido a frutose 1,6 bisfosfato utilizando as reações reversíveis da via glicolítica. A formação de frutose 6 fosfato é catalisada pela frutose 1,6 bisfosfatase, uma enzima Mg2+-dependente que libera fosfato livre. Há então isomerização para formar glicose 6 fosfato, que é hidrolisada pela glicose 6 fosfatase a glicose. A glicose 6 fosfatase é uma enzima que se encontra no retículo endoplasmático apenas de células hepáticas e renais, os únicos tecidos capazes de realizar gliconeogênese.

Como balanço global, para cada glicose sintetizada pela gliconeogênese, são consumidos dois piruvatos, 4 ATPs, 2 GTPs e 2 NADHs. O piruvato não é a única fonte de carbonos para este processo - podem também ser utilizados como precursores oxaloacetato e outros intermediários do ciclo do ácido cítrico, provenientes da degradação de alguns aminoácidos, por exemplo. Somente a acetil-CoA, gerada por exemplo a partir de aminoácidos cetogênicos ou ácidos graxos com número de carbonos par, não pode gerar ATP, pois a sua entrada no ciclo do ácido cítrico é acompanhada da saída de dois carbonos na forma de CO2, impedindo que haja ganho na concentração de intermediários.

A presença de reações irreversíveis da via glicolitica de gliconeogênica com produtos e reagentes comuns poderia levar à ocorrência de ciclos fúteis com gasto de ATP, se não houvesse a regulação necessária para que as reações não possam ocorrer simultaneamente. Como exemplo, a frutose 2,6 bisfosfato, que estimula a fosfofrutoquinase I, é um potente inibidor da frutose 1,6 bisfosfatase. A frutose 2,6 bisfosfato é formada pela ação da fosfofrutoquinase II, que faz parte de um complexo multienzimático que também apresenta atividade de frutose 2,6 bisfosfatase. Este complexo é regulado por fosforilação, estimulada pela presença de glucagon, com estímulo da atividade de fosfatase e inibição da atividade quinásica.

A gliconeogênese é também praticada por sementes, em que a acetil-CoA pode ser utilizada como precursor devido ao ciclo do glioxalato. Nas sementes, o objetivo é sintetizar sacarose, que fornece a energia necessária para o crescimento.

O excesso de glicose produzida em diferentes organismos pode ser convertido em formas poliméricas para transporte ou estocagem. Em plantas, a principal forma de estoque é o amido, enquanto em vertebrados em vários microorganismos é o glicogênio. A forma de transporte em vertebrados é geralmente a própria glicose, mas em insetos é a tralose e em plantas é predominantemente a sacarose.

Muitas das reações de polimerização de hexoses envolvem a participação de nucleotídeos de açúcar, compostos em que o carbono anomérico de um açúcar é ligado a um nucleotídeo por uma ligação fosfodiéster, numa forma de ativação deste açúcar, descrita por Leloir. Este tipo de ativação facilita ataques nucleofílicos e contribui para a irreversibilidade dos processos envolvidos, direcionando-os.

Um exemplo da participação de nucleotídeos de açúcar é a síntese de glicogênio, que envolve a formação de UDP-glicose. A síntese de glicogênio ocorre em praticamente todos os tecidos, mas é mais proeminente em fígado e músculo. Inicia-se pela conversão de glicose 6 fosfato em glicose 1 fosfato pela fosfoglicomutase. Há então formação de UDP-glicose pela ação da UDP glicose fosforilase, liberando pirofosfato a partir de UTP. A UDP glicose serve como substrato para a glicogênio sintase, que adiciona uma glicose em ligação α1→4 na ponta não redutora de uma molécula de glicogênio pré-existente, liberando UDP. A enzima ramificadora transforma algumas das ligações α1→4 em α1→6, criando ramificações na molécula, que permitem uma forma mais compacta e uma liberação maior de glicoses quando a ação da glicose fosforilase predomina. A glicogênio sintase requer uma molécula pré-formada de glicogênio, cuja síntese é iniciada pela glicogenina, que catalisa a ligação dos primeiros resíduos de glicose, e interage com a única ponta redutora desta macromolécula.

A regulação da síntese e degradação de glicogênio ocorre predominantemente pela fosforilação reversível das enzimas envolvidas. A glicogênio sintase fosforilada, que predomina quando há ação de glucagon e epinefrina, assume a forma b, menos ativa. Ao mesmo tempo, a glicogênio fosforilase é ativada por fosforilação, evitando ciclos fúteis.

O amido possui uma estrutura semelhante ao glicogênio, e é sintetizado em cloroplastos, como um dos produtos finais da fotossíntese, descrita a seguir. O mecanismo de síntese é semelhante ao do glicogênio, mas envolve ADP-glicose, que é adicionada ao amido pela amido sintase. A ADP-glicose é também utilizada para a síntese de glicogênio em bactérias.

Parte do carbono fixado na fotossíntese das plantas é convertido a sacarose para ser transportado. A síntese utiliza UDP-glicose e frutose 6 fosfato como precursores, formando sacarose 6 fosfato, pela ação da sacarose 6 fosfato sintase. A sacarose é formada por hidrólise catalisada pela sacarose 6 fosfato fosfatase.

Como precursores para a síntese de sacarose e amido, as plantas utilizam carboidratos formados por fotossíntese, durante a fase de fixação de carbono, utilizando ATP e NADPH formado durante a fase clara. O produto inicial da fase de fixação de carbono é 3 fosfoglicerato, que age como precursor da síntese de carboidratos e de outras moléculas orgânicas. A fixação de CO2 na forma de 3 fosfoglicerato ocorre durante o ciclo de Calvin, desvendado no início dos anos 50.

A fixação de CO2 se inicia com sua condensação com um açúcar de cinco carbonos, a ribulose 1,5-bisfosfato, com formação de duas moléculas de e fosfoglicerato, numa reação catalisada pela ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase, ou rubisco. Esta enzima, a mais abundante na Terra, possui uma estrutura complexa, com oito subunidades grandes e oito pequenas em plantas, e apenas duas em bactérias, com estrutura semelhante às subunidades grandes de plantas. É interessante que a rubisco não tem grande especificidade por CO2, podendo ter também atividade fútil de oxigenase, que limita a capacidade de crescimento da planta. Para evitar este processo, algumas plantas (plantas C4) fixam o CO2 primeiro como oxaloacetato através da fosfoenolpiruvato carboxilase. O CO2 é regenerado depois pela enzima málica em células vizinhas com menor acesso a O2 atmosférico e incorporado pela rubisco.

O 3 fosfoglicerato é então convertido a 1,3 bisfosfoglicerato pela 3 fosfoglicerato quinase, com consumo de ATP. Em seguida a gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase promove uma redução gerando gliceraldeído 3 fosfato, com elétrons provindos de um NADPH.

Para regenerar a ribulose 1,5-bisfosfato gasta, gliceraldeído 3 fosfato de diidroxiacetona fosfato gerada a partir dele se condensam, formando frutose 1,6 bisfosfato, que é hidrolisada a frutose 6 fosfato. A frutose 6 fosfato e gliceraldeído 3 fosfato sofrem ação de uma transcetolase, gerando eritrose 4 fosfato e xilulose 5 fosfato. A xilulose 5 fosfato produz ribulose 5 fosfato por ação direta de uma epimerase, enquanto a eritrose pode ser transformada em outros açúcares por outras reações análogas às reações da via das pentoses. A fosforilação da ribulose 5 fosfato pela ribulose 5 fosfato quinase é então realizada, com gasto de ATP.

Deste modo, levando em conta todas as transformações possíveis, para cada 3 CO2 incorporados há como saldo a síntese de uma triose fosfato, com gasto de 9 ATPs e 6 NADPH (no caso de gliceraldeído 3 fosfato e diidroxiacetona fosfato). A fonte destes NADPHs e ATP é a fase clara da fotossíntese. Deste modo, as reações de fixação de carbono dependem da fase clara, e cessam na ausência de luz, sendo incorreto denominá-las reações de fase escura.

A regulação da fotossíntese se dá em várias etapas. A rubisco é um dos principais pontos de regulação, e pode ser ativada por carbamilação de um resíduo de lisina, que ocorre altas tensões de CO2, de modo estimulado pela rubisco ativase. A atividade de enzimas do estroma é freqüentemente modulada por Mg2+ que, na presença de luz, sai dos compartimentos tilacóides devido ao aumento de ΔpH. Um exemplo deste tipo de modulação é da frutose 1,6 bisfosfatase, que, além de depender de Mg2+, também é ativada pela mudança de pH. Pode também haver modulação de atividade através do estado redox de resíduos de cisteínas, que inativam a enzima quando em ligação cruzada. A redução da ferrodoxina durante a fase clara estimula a redução de tiorredoxina que age como substrato para a tiorredoxina redutase, catalisando a redução de dissulfetos e ativação destas enzimas. A atividade da fosfofrutoquinase I dependente de pirofosfato de plantas é ativada por frutose 2,6 bisfosfato, formado pela fosfofrutoquinase II, que é inibida por ATP formado pela fase clara. Deste modo, a síntese de sacarose só ocorre quando a concentração de diidroxiacetona fosfato é grande, deslocando esta reação inibida. Assim, só ocorre síntese de sacarose quando a síntese de trioses pelo ciclo de Calvin é excedente, impedindo a depleção de ribulose 1,5-bisfosfato.

Catabolismo de Hexoses
A oxidação da D-glicose pode liberar até cerca de 2800 kJ/mol, e é a maior fonte de energia para a maioria dos organismos, ocupando uma posição central no metabolismo, agindo não só como fonte energética mas também como precursor de macromoléculas. E. coli, por exemplo, podem obter a partir de glicose os esqueletos carbônicos de qualquer composto necessário para seu crescimento. Em organismos mais complexos, a glicose segue três vias principais: ser estocada na forma de polisacarídeo, ser oxidada a um composto de três carbonos pela via glicolítica ou ser oxidada a uma pentose pela via das pentoses. Descreveremos estas duas últimas vias a seguir.

Na via glicolítica, uma molécula de glicose é degradada até duas moléculas de piruvato em uma série de reações catalisadas enzimaticamente, liberando energia conservada na forma de ATP e NADH. Esta foi a primeira via metabólica a ser compreendida, e possui uma importância grande, pois compreende o maior fluxo de carbonos na maioria das células, sendo a fonte única de energia em algumas. A fermentação, ou quebra anaeróbica da glicose, é provavelmente a fonte mais antiga de energia para seres vivos, desenvolvida na presença de uma atmosfera redutora, pobre em oxigênio. Esta hipótese é apoiada pela alta conservação dos passos e enzimas da via glicolítica nas várias espécies.

A via glicolítica pode ser dividida em duas fases. Na primeira fase, há preparação das moléculas, com gasto de duas moléculas de ATP e clivagem da hexose em duas trioses fosfato. O primeiro passo envolve a fosforliação da glicose em C-6, com ATP como doador fosforil, formando glicose 6 fosfato. Esta reação irreversível é catalisada pela hexoquinase (ou glicoquinase no fígado) e requer Mg2+. A formação de glicose 6 fosfato é um passo inicial não só da glicólise mas também da síntese de glicogênio e via das pentoses. Tem como função, além de ativar a molécula, impedir a saída de glicose da célula, pois as membranas biológicas não transportam glicose 6 fosfato.

A seguir, a fosfohexose isomerase catalisa a reação reversível de isomerisação de glicose 6 fosfato, uma aldose em frutose 6 fosfato, uma cetose. A frutose 6 fosfato é então fosforilada em C-1 pela fosfofrutoquinase 1, gerando frutose 1,6 bisfosfato, com gasto de mais uma molécula de ATP ou pirofosfato (em algumas bactérias e plantas). Esta reação é irreversível e dependente de Mg2+.

A frutose 1,6 bisfosfato é então clivada pela aldolase, numa reação que gera duas trioses fosfato, a diidroxiacetona fosfato e gliceraldeído 3 fosfato. Em condições padrão, a reação é altamente direcionada para a formação de trioses, mas em condições intracelulares é reversível. Somente o gliceraldeído 3 fosfato segue a via glicolítica, mas a diidroiacetona fosfato pode ser rapidamente interconvertida a gliceraldeído 3 fosfato pela triose fosfato isomerase, numa reação reversível. A via glicolítica prossegue então com duas moléculas de gliceraldeído 3 fosfato.

Na segunda fase da via glicolítica, há oxidação de gliceraldeído 3 fosfato e liberação de energia, gerando ATP e NADH. Há formação de 2 ATPs e um NADH por molécula de gliceraldeído 3 fosfato, o que equivale a 4 ATPs e 2 NADHs por glicose. Esta fase se inicia com a oxidação de gliceraldeído 3 fosfato a 1,3 bsifosfoglicerato, catalisada pela gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase. O grupo aldeído do gliceraldeído é dehidrogenado a anidrido fosfórico, formando uma ligação fosfórica rica em energia às custas da oxidação, o que torna a reação global reversível. Há redução de NAD+ e gasto de um Pi. Esta reação é inibida por iodoacetato, que foi uma ferramenta importante para a compreensão das reações envolvidas na glicólise.

O 1,3 bisfosfoglicerato transfere então sua ligação rica em energia para o ADP, formando ATP e 3 fosfoglicerato, numa reação reversível catalisada pela fosfoglicerato quinase, de modo dependente de Mg2+. Esta é a primeira fosforilação ao nível de substrato da glicólise. O 3 fosfofoglicerato é convertido então a 2 fosfoglicerato pela fosfoglicerato mutase dependente de Mg2+. O 2 fosfoglicerato é então desidratado a fosfoenolpiruvato pela ação da enolase, numa nova reação reversível. A perda de uma molécula de água causa uma redistribuição energética que permite a formação de uma ligação fosfoenol rica em energia em uma reação com pouca variação de energia livre.

Por fim, o fosfoenolpiruvato transfere seu grupo fosforil parra ADP, de modo catalisado pela piruvato quinase, formando piruvato e ATP. Esta reação é dependente de K+ e Mg2+ ou Mn2+ e é irreversível devido ao alto conteúdo energético da ligação fosfoenol. O piruvato é formado na sua forma enol, mas rapidamente se tautomeriza a pH fisiológico para a forma predominante de cetona.

A reação global da glicólise envolve a geração de duas moléculas de piruvato, conversão de duas moléculas de NAD+ em NADH e conversão de 2 ADP + 2 Pi em 2 ATP. A conversão de glicose e NAD+ em piruvato e NADH possui ΔG´0 = -146 kJ/mol. A conversão de 2 ADP + 2 Pi em 2 ATP possui ΔG´0 = 61 kJ/mol. Deste modo, a eficiência de conversão energética desta reação em condições padrão é cerca de 40%, chegando a cerca de 60% em condições intracelulares. A diferença de energia liberada versus convertida a ATP garante a espontaneidade e irreversibilidade da via.

É interessante notar que algumas enzimas da glicólise existem na forma de complexos multienzimáticos, que permitem maior eficiência de metabolização, pois o produto de uma enzima é passado diretamente para a próxima enzima. Um exemplo de complexo multienzimático envolve a gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, que interage com a fosfoglicerato quinase.

O piruvato pode seguir vários caminhos metabólicos distintos. Em organismos aeróbicos, o piruvato sofre uma descarboxilação oxidativa, sendo ligado a uma coenzima A, formando acetil-CoA, que é completamente oxidada no ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Em condições hipóxicas, o piruvato pode ser reduzido a lactato, em um processo catalisado pela lactato desidrogenase, a fermentação lática. Este processo permite a recuperação de NAD+ reduzido durante a glicólise, e garante a continuidade da via glicolítica na ausência de O2,. Finalmente, alguns organismos realizam fermentação alcoólica, convertendo o piruvato a acetaldeído e CO2 por ação da piruvato decarboxilase, uma enzima dependente de tiamina pirofosfato, derivada da vitamina B1. O acetaldeído e um NAD+ são então convertidos a etanol e NADH pela álcool desidrogenase.

Muitos carboidratos além da glicose são metabolizados pela via glicolítica, sendo primeiramente transformados em glicose ou um dos intermediários desta via. As formas mais significativas de estocagem de glicose em plantas e animais são o amido e glicogênio, respectivamente. Para entrar na via glicolítica, unidades de glicose 1 fosfato destas macromoléculas são liberadas por glicogênio ou amido fosforilase, que catalisam a fosforólise das ligações glicosídicas α1→4. Estas enzimas dependem de piridoxal fosfato, que estimula o ataque por Pi na ligação glicosídica. A glicose 1 fosfato é convertida a glicose 6 fosfato pela fosfoglicomutase. As ligações α1→6 do glicogênio são removidas pela enzima desramificadora, que transfere todos os resíduos do ramo menos a glicose inicial par uma outra seqüência de glicoses, permitindo a sua remoção pela glicogênio fosforilase. A enzima desramificadora também catalisa a liberação da primeira glicose como glicose livre.

A D frutose pode entrar na via glicolítica sendo fosforilada a frutose 6 fosfato pela própria hexoquinase. A D galactose, produzida, por exemplo, a partir da hidrólise da lactose, é fosforilada a galactose 1 fosfato pela galactoquinase. A galactose se combina com UDP-glicose, gerando UDP-galactose e glicose 1 fosfato, convertida a glicose 6 fosfato pela fosfoglicomutase. A UDP galactose é então convertido a seu epímero UDP-glicose, podendo se combinar com outra galactose 1 fosfato. A deficiência desta combinação de UDP glicose com galactose 1 fosfato é freqüente causa de uma doença genética, a galactosemia. A D manose é fosforilada pela hexoquinase a manose 6 fosfato, que é então isomerizada a frutose 6 fosfato.

Para manter os níveis intracelulares de ATP adequados constantemente, o metabolismo de hexoses deve ser finamente regulado. As principais enzimas regulatórios do catabolismo de hexoses são a glicogênio fosforilase, a hexoquinase, a fosfofrutoquinase 1 e a piruvato quinase. As três últimas enzimas fazem parte da via glicolítica em si, e constituem os passos irreversíveis desta, que são determinantes para estabelecer a atividade da via completa.

A hexoquinase é inibida alostericamente pelo seu produto, glicose 6 fosfato, o que inibe a ação desta enzima em condições em que não há metabolização da glicose 6 fosfato por uma das várias vias que pode seguir. Na ausência de inibição alostérica, esta enzima possui alta afinidade por glicose e trabalha em velocidade máxima independentemente da concentração plasmática de glicose. A glicoquinase possui uma afinidade menor por glicose, estando apenas 50% saturada em concentrações fisiológicas de glicose, e tendo atividade diminuída ou aumentada de acordo com a concentração plasmática. A glicoquinase não é inibida por glicose 6 fosfato, permitindo que o fígado fixe altas quantidades de glicose.

A fosfofrutoquinase 1 possui uma regulação complexa, que inclui inibição alostérica por ATP e citrato e ativação por AMP, ADP e frutose 2,6 bisfosfato (um regulador forte da atividade desta enzima). A frutose 2,6 bisfosfato é formada a partir de frutose 6 fosfato pela ação da fosfofrutoquinase 2, uma enzima com função regulatória. A atividade da fosfofrutoquinase 2 também é modulada alostericamente por ATP (inibidor), ADP e AMP (ativadores). Deste modo, a fosfofrutoquinase 1 (e a via glicolítica em si) são estimulados pela queda nas relações intracelulares de ATP/ADP

A piruvato quinase é inibida alostericamente por ATP, alanina, acetil CoA e ácidos graxos de cadeia longa. Deste modo, está inibido em condições em que a relação ATP/ADP é alta e ocorre neoglicogênese.

A glicogênio fosforilase é uma enzima regulatória importante, cuja principal resposta é a reguladores hormonais. Existe nas formas a (mais ativa), estimulada pela presença de epinefrina ou glucagon e Ca2+ (no músculo), e b (menos ativa). A atividade da enzima é também alostericamente estimulada por AMP.

Além de seguir a via glicolítica, a glicose 6 fosfato possui outro destino metabólico importante: a via das pentoses, que gera NADPH e ribose 5 fosfato. A atividade desta via é especialmente importante em tecidos que sintetizam ácidos graxos e esteróis, por causa do alto gasto e NADPH como fonte redutora. Esta via também possui papel importante em tecidos com alto índice replicativo (como os tumores, por exemplo), por gerar D ribose, precursor de ácidos nucléicos.

A via das pentoses se inicia com a conversão de glicose 6 fosfato em 6 fosfogluconato lactona, pela ação da glicose 6 fosfato desidrogenase, reduzindo um NADP+. Esta lactona é hidrolizada a 6 fosfogluconato pela lactonase. Há então uma descarboxilação oxidativa pela 6 fosfogluconato desidrogenase, gerando D ribulose 5 fosfato e reduzindo mais um NADP+. A ribose 5 fosfato pode então ser metabolizada por epimerases, transcetolases e transaldolases para gerar vários açúcares fosforilados distintos. A deficiência parcial da atividade da glicose 6 fosfato desidrogenase gera um déficit na geração intracelular de NADPH. Como esta é a principal fonte de elétrons para a redução de glutationa oxidada, e a glutationa é substrato da glutationa peroxidase, uma enzima importante na remoção de H2O2, há maior tendência a dano oxidativo nestes indivíduos, principalmente após o uso de drogas que geram espécies reativas de oxigênio intracelulares, como a primaquina. É interessante notar que esta deficiência confere resistência parcial à infecção por plasmódios, que são destruídos pelo ambiente ligeiramente mais oxidativo nas hemácias de indivíduos acometidos.

Ciclo do Ácido Cítrico
O piruvato formado a partir da glicólise ainda contém alta capacidade de gerar energia, tornando sua oxidação completa muito mais lucrativa que processos fermentativos simples. Deste modo, a maioria das células eucarióticas e muitas bactérias realizam a oxidação completa da glicose a CO2 e H2O, um processo que requer a presença de O2. Além da glicose, outros substratos como ácidos graxos e cadeias carbônicas de aminoácidos podem ser completamente oxidados na presença de O2. Esta oxidação se dá em três fases. Primeiro há oxidação destes compostos em fragmentos de dois carbonos que convergem na forma do grupo acetil da acetil CoA. A seguir, os grupos acetil são oxidados no ciclo do ácido cítrico, liberando O2 e reduzindo NAD+ e FAD. Por fim, as coenzimas reduzidas são reoxidadas na cadeia respiratória. Iremos descrever aqui o processo de conversão de piruvato em acetil CoA, e, a seguir, o ciclo do ácido cítrico (ou ciclo dos ácidos tricarboxílicos), cujos passos foram detalhadamente descritos por Krebs e Kornberg em 1957.

A produção de acetil CoA a partir de piruvato é catalisada pela piruvato desidrogenase, um complexo de três enzimas (piruvato desidrogenase, diidrolipoil transacetilase e diidrolipoil desidrogenase) localizado na matriz mitocondrial de eucariotos e no citosol de procariotos. Como cada enzima pode estar em mútiplas cópias no complexo, trata-se de uma proteína de grande tamanho, maior que o ribossomo em algumas espécies. A reação global catalisada consiste em uma descarboxilação oxidativa, com remoção de CO2 e redução de um NAD+, numa reação irreversível. Esta reação requer a presença de cinco coenzimas: tiamina pirofosfato, FAD, CoA, NAD e lipoato, derivados da tiamina, riboflavina, pantotenato, niacina e ácido lipóico, respectivamente.

A reação catalisada pela piruvato desidrogenase prossegue em cinco passos. Primeiro há liberação de C-1, na forma de CO2, e C-2 é ligado à tiamina pirofosfato como grupo hidroxietil. O segundo passo consiste na oxidação do grupo hidroxietil, com redução do dissulfeto do grupo lipoil a dois tióis reduzidos. O terceiro passo consiste em trocar a ligação entre o acetil formado com o grupo lipoil pela ligação com o tiol da CoA, liberando acetil-CoA. O quarto passo envolve a transferência de elétrons dos dissulfetos do lipoil para um FAD prostético. O FADH2 formado é capaz de reduzir um NAD+, liberando NADH, devido ao seu potencial de óxido-redução alterado pelo ambiente protéico.

A deficiência de tiamina, que pode ocorrer por deficiência alimentar e/ou alcoolismo crônico, causa Beriberi e leva à disfunção da piruvto desidrogenase e falha energética em todo organismo. Seus principais sintomas sugerem acometimento neurológico, pois este tecido possui alta demanda de metabolismo energético oxidativo.

A acetil-CoA formada está agora pronta para continuar a ser oxidada no ciclo do ácido cítrico, cujas enzimas também se localizam na matriz mitocondrial em eucariotos, como demonstrado por Kennedy e Lehninger em 1948.

A primeira transformação do cíclo do ácido cíclico envolve a condensação de acetil-CoA com oxaloacetato, liberando CoA e citrato, de modo catalisado pela citrato sintase. Nesta reação há uma ligação entre a metila do grupo acetil e a carbonila C-2 do oxaloacetato. Por causa da hidrólise da ligação com a CoA, a reação é altamente exergônica, permitindo que ocorra de maneira eficiente apesar das concentrações baixas de oxaloacetato no interior da mitocôndria.

A seguir, há formação de isocitrato a partir do citrato, numa reação catalisada pela aconitase que envolve a desidratação do citrato, formando cis-aconitase e reidratação, formando isocitrato. A aconitase é uma enzima que contém um centro ferro enxofre e é inibida por radicais ânion superóxido e peroxinitrito, podendo ser utilizada como um sensor intracelular de estado redox.

O isocitrato é então oxidado a α-cetoglutarato, numa reação catalisada pela isocitrato desidrogenase, que pode reduzir tanto NAD+ quanto NADP+ no processo. A seguir, ocorre mais uma descarboxilação oxidativa, catalisada pela α-cetoglutarato desidrogenase e formando succinil-CoA, NADH e CO2. O mecanismo desta reação é muito semelhante ao apresentado para a piruvato desidrogenase, e a semelhança estrutural entre estas duas enzimas sugere que tenha origem comum. É interessante notar que estudos recentes de Starkov e colaboradores sugerem que o complexo α-cetoglutarato desidrogenase seja um dos principais sítios de geração de espécies reativas de oxigênio mitocondriais, junto com os complexos respiratórios I e III, além de, em menor proporção, piruvato desidrogenase.

A ligação tioéster da succinil-CoA é então hidrolisada formando succinato, numa reação acoplada à formação de GTP a partir de GDP e Pi, catalisada pela succinil-CoA sintase. O GTP formado pode ser rapidamente convertido a ATP pela nucleosídeo difosfato quinase. Animais também possuem uma isoforma desta enzima capaz de utilizar ADP ao invés de GDP. O mecanismo de reação enzimático envolve a fosforilação temporária de um resíduo de histidina na enzima, e posterior transferência desta ligação para ADP ou GDP.

O succinato formado é então oxidado a fumarato pela succinato desidrogenase, uma enzima ligada à face matricial da membrana interna mitocondrial. Há redução de FAD, que então transfere seus elétrons para carreadores intramembranares que compõe a cadeia transportadora de elétrons. O fumarato formado é liberado na matriz mitocondrial, onde é hidratado a L-malato, pela ação da fumarase. O L-malato sofre a última redução do ciclo, gerando NADH e oxaloacetato de modo catalisado pela malato desidrogenase. O oxaloacetato formado está então disponível para reiniciar o ciclo, se combinando com outra acetil-CoA.

Como resultado final do ciclo do ácido cítrico, para cada acetil-CoA que entra o ciclo, são liberados 3 NADH, 1 FADH2, 1 GTP (ou ATP), uma CoA e 2 CO2. A transferência de elétrons desses NADHs e FADH2 durante a fosforilação oxidativa irá formar a maioria dos ATP formados a partir da glicose.

Além de ter a função de levar à oxidação completa do piruvato, o ciclo do ácido cítrico serve como fonte de vários intermediários metabólicos. É também para intermediários deste ciclo que convergem vários catabólitos provenientes do metabolismo de aminoácidos e ácídos graxos com número ímpar de carbonos, por exemplo. É provável que partes do ciclo tenham evoluído antes do surgimento do metabolismo aeróbico com a finalidade de gerar e degradar estes metabólitos, sendo depois aproveitados como mecanismo para oxidação de piruvato. Como várias vias metabólicas convergem e partem de intermediários deste ciclo, sua velocidade de funcionamento depende da atividade de várias vias metabólicas.

Além de poder ser repostos por cadeias carbônicas de aminoácidos, o oxaloacetato pode ser reposto a partir do piruvato, numa reação catalisada pela piruvato carboxilase. Esta enzima utiliza biotina como grupo prostético para fixar o CO2 (na forma de bicarbonato) a ser inserido no piruvato, e gera a energia necessária para esta reação hidrolisando ATP. A piruvato carboxilase é fortemente estimulada pelo acúmulo de acetil-CoA, garantindo a geração de oxaloacetato quando há acúmulo de acetil-CoA por falta de substrato para a citrato sintase.

A ocorrência do ciclo do ácido cítrico e outras reações orgânicas pode ser monitorada utilizando 13C monitorado por NMR. Esta técnica permite o acompanhamento do fluxo de carbonos por diferentes vias metabólicas, especificando suas interconexões e atividades em diferentes condições.

Além de limitações de velocidade de reação determinadas por concentração de intermediários, a regulação do ciclo do ácido cítrico se dá por regulação alostérica enzimática em vários pontos, sendo os mais importantes a piruvato desidrogenase, a citrato sintase, a isocitrato desidrogenase e a α-cetoglutarato desidrogenase.

A piruvato desidrogenase é inibida fortemente por ATP, caetil-CoA e NADH, de modo estimulado pela presença de ácidos graxos. É ativada por AMP, CoA NAD+ e íons Ca2+. Além disso, em vertebrados, esta enzima é inibida por fosforilação de um resíduo específico de serina. Em plantas, a enzima aparentemente é modulada também por fosforilação, mas o modulador mais importante de sua atividade é NADH.

A citrato sintase é inibida por NADH, succinil-CoA, citrato e ATP, sendo estimulada por ADP. Sua inibição por ATP é menos intensa que a da isocitrato desidrogenase, que permite a síntese de citrato mesmo em condições de alto ATP, essencial para a biossíntese de ácidos graxos. Além da inibição por ATP, a isocitrato desidrogenase tem sua atividade estimulada por ADP e Ca2+. A inibiçõa desta enzima resulta em acúmulo de citrato, já que a reação reversível catalisada pela aconitase tem como sentido preferencial a formação de citrato. A α-cetoglutarato desidrogenase é inibida por ATP, succinil-CoA e NADH, e estimulada por Ca2+. Assim, de modo geral, a atividade do ciclo é aumentada em baixas relações ATP/ADP e NADH/NAD+, quando há aumento do Ca2+ intracelular e baixas concentrações de intermediários posteriores do ciclo.

Por causa da característica altamente exergônica da reação de fosfoenolpiruvato a piruvato e depois acetil-CoA, esta é irreversível. Assim, a acetil-CoA gerada pela oxidação de ácidos graxos não pode ser diretamente convertida a fosfoenolpiruvato e outros carboidratos em vertebrados. Em outros organismos, uma modificação do ciclo do ácido cítrico, o ciclo do glioxalato, converte acetil-CoA em carboidrato. Há formação de isocitrato a partir de acetil-CoA e oxaloacetato pelos mesmos mecanismos que o ciclo do ácido cítrico. O isocitrato é então clivado a succinato e glioxalato pela isocitrato liase. O glioxalato resultante se condensa com outra molécula de acetil-CoA, fromando malato, de forma catalisada pela malato sintase. O malato então regenera o oxaloacetato. Como resultado, o ciclo consome duas moléculas de acetil-CoA por volta e gera uma molécula de succinato. O succinato pode ser convertido a oxaloacetato e, através a fosfoenolpiruvato carboxiquinase, numa reação que gasta GTP, gerar fosfoenolpiruvato e outros carboidratos.

Em plantas, o ciclo do glioxalato ocorre em organelas especializadas, os glioxissomos, que são abundantes em sementes, onde não há síntese de carboidratos por fotossíntese. Estas organelas também oxidam ácidos graxos a acetil-CoA. A atividade da isocitrato liase é inibida por AMP e ADP, de modo que a conversão de ácidos graxos em carboidrato só ocorre em condições de alta relação ATP/ADP. A atividade do ciclo do glioxalato é também estimulada pela inibição (por exemplo por fosforilação) da isocitrato desidrogenase.

Fosforilação Oxidativa
A fosforilação oxidativa compreende a redução de O2 a H2O concomitantemente à síntese de ATP. É o estágio final da oxidação completa de carboidratos, lipídeos e proteínas, e consiste na principal forma de geração de ATP em eucariotos que não realizam fotossíntese.

Kennedy e Lehninger demonstraram em 1948 que a fosforilação oxidativa ocorria exclusivamente na mitocôndria de eucariotos. Estas organelas são compostas por duas membranas, sendo a externa permeável a íons e pequenas moléculas, enquanto a interna é altamente impermeável, e contém grande conteúdo protéico que inclui a ATP sintase, componentes da cadeia respiratória (transportadora de elétrons) e transportadores de ADP/ATP, fosfato, piruvato, e ácidos graxos, dentre outros. Na matriz mitocondrial se encontram a maioria das enzimas do ciclo do ácido cítrico e β-oxidação, além de parte das enzimas que realizam o catabolismo de aminoácidos e o DNA mitocondrial.

A fonte de elétrons para a redução do O2 é diversa, mas eles são colecionados em aceptores universais: NAD+ e FAD (NADP+ não doa elétrons para a cadeia de transporte de elétrons, apesar de agir também como aceptor de elétrons para outros fins). NADH é solúvel em água, e trafega livremente entre as enzimas em que é reduzido e a cadeia de transporte de elétrons, onde é oxidado. O FADH2 não apresenta esta propriedade, sendo fortemente ligado às proteínas que o possuem (flavoproteínas). Estas proteínas estão intimamente associadas à membrana mitocondrial interna e permitem tanto a redução do FAD quanto a sua re-oxidação dentro do mesmo ambiente.

Os elétrons são transportados do NADH e FADH2 para o O2 em reações seqüenciais de óxido-redução que envolvem componentes da cadeia respiratória. Estas passagens obedecem aos potenciais de óxido-redução, com aumento progressivo destes, de cerca de -0,4 V para o par NAD+/NADH até cerva de 0,8 V para o par ½O2/H2O. Várias das proteínas que realizam esta transferência de elétrons são proteínas ferro-enxofre, descritas inicialmente por Beinert, que contém ferro em associação com enxofres de resíduos de cisteína. Há também proteínas de Rieske, em que o ferro se associa com resíduos de histidina. O ferro também participa de reações de óxido-redução como parte do grupo heme, quando contido em anéis profirínicos, como é o caso dos citocromos. Por fim, elétrons também são transportados pela ubiquinona (ou coenzima Q), uma benzoquinona lipossolúvel que pode ser reduzida por um elétrona ao radical semiquinona ou por dois elétrons para formar ubiquinol.

As proteínas que compõem a cadeia de transporte de elétrons se organizam em quatro complexos multiprotéicos que podem ser separados por métodos de fracionamento.

O complexo I, ou NADH: ubiquinona oxidoredutase consiste em um complexo de alta massa molecular cuja estrutura ainda é pouco compreendida, mas que envolve mais de 40 polipeptídeos em humanos. Dentre estas está uma flavoproteína que contém FMN e pelo menos seis centros ferro-enxofre. Este complexo catalisa a transferência exergônica de elétrons do NADH para a ubiquinona, acompanhado de uma transferência endergônica de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembranas. A estequiometria mais aceita para estas reações é de quatro prótons translocados por par de elétrons transportados. A transferência de elétrons por este complexo é inibida por amital, um barbitúrico, rotenona, um inseticida produzido por plantas e piericidina A, um antibiótico. É interessante notar que o Complexo I se encontra sistemicamente inibido em pacientes com doença de Parkinson, e que a inibição parcial do complexo I em animais experimentais gera parkinsonismo, sugerindo que este é um mecanismo causal da doença.

Além do complexo I, outras enzimas podem catalisar a transferência de elétrons do NADH para a ubiquinona sem transporte de prótons associados. Estas NADH desidrogenases podem estar localizadas na face intermembranas ou matricial da membrana interna. Foram identificadas inicialmente em eucariotos monocelulares e plantas, mas hoje já foram descritos também em vertebrados.

Elétrons também podem ser transportados para a ubiquinona pelo complexo II, ou succinato desidrogenase. Esta enzima contém FAD como grupo prostético, além de um centro ferro-enxofre, e catalisa transformação de succinato em fumarato, ao mesmo tempo que reduz FAD e o re-oxida, transferindo seus elétrons para a ubiquinona. O complexo II pode ser inibido competitivamente por malonato e não competitivamente por 3-nitro proprionato. Sua inibição parece fazer parte importante da patologia da doença de Huntington.

A ETF (electron transferring flavoprotein): ubiqunona oxidoredutase e glicero fostato desidrogenase também transferem elétrons à ubiquinona, provenientes da β-oxidação e glicerol fosfato citosólico, respectivamente, sem transportar prótons.

A ubiquinona é uma molécula lipossolúvel, pequena e com bastante mobilidade. Esta molécula se desliga das enzimas que a reduzem a ubiquinol e se associa ao complexo III, ou complexo bc1, ou ubiquinona-citocromo c oxidoredutase. Há então transferência seqüencial de seus dois elétrons para a proteína de Rieske (num processo inibido por mixotiazol) e grupo heme do citocromo bL, que reduz citocromo bH e uma ubiquinona, formando um radical semiquinona ligado ao sítio Qn. Um segundo ubiquinol se liga, transferindo um elétron para a proteína Rieske e outro para os citocromos bL e bH, regenerando ubiquinol livre a partir da ubiquinona. A antimicina A previne este segundo elétron de ser transportado para Qn, resultando no acúmulo de semiquinona. Os elétrons da proteína de Rieske são transferidos ao citocromo c1 e posteriormente ao citocromo c, num processo inibido por stigmatelina. O transporte de elétrons pelos diferentes componentes do complexo III é acompanhado de translocamento de prótons para o espaço intermembranas, sendo a estquiometria melhor aceita quatro prótons por par de elétrons, sendo dois provenientes da matriz e dois do próprio ubiquinol.

O citocromo c é uma proteína pequena que se associa à face intermembranar da membrana mitochondrial interna, e trafega entre o complexo III, onde é reduzida, ao complexo IV, onde é oxidada. Além de sua função na cadeia de transporte de elétrons, o desligamento desta proteína da membrana mitocondrial interna e passagem através de poros formados na membrana externa é um evento inicial da apoptose, necessário para a formação do apoptossomo. Por fim, o citocromo c também possui uma importante função no balanço redox, pois pode receber elétrons de radicais superóxido e os re-introduzir na cadeia respiratória, além de agir como substrato da citocromo c peroxidase, que remove H2O2.

O complexo IV, ou citocromo oxidase utiliza elétrons trazidos pelo citocromo c para reduzir o O2 a água em quatro passos de redução monoeletrônica. A enzima é especializada na ligação forte com os intermediários parcialmente reduzidos do oxigênio, não permitindo sua liberação na forma de radicais livres. É uma enzima grande que contém ferro em hemes e centros ferro-enxofre, além de cobre. O transporte de elétrons é associado ao bombeamento de um próton por elétron da matriz para o espaço intermembranas e transporte de quatro prótons da enzima para o espaço intermembranas, resultando em oito cargas positivas mobilizadas por quatro elétrons transferidos ao oxigênio. O complexo IV é inibido por monóxido de carbono e cianeto, além de ser fisiologicamente regulado por óxido nítrico.

Além da via clássica dos citocromos, elétrons da ubiquinona podem ser transferidos diretamente ao O2 por oxidases alternativas presentes em plantas e fungos. Estas oxidases podem ter função termogênica em plantas que crescem em climas frios ou com função de liberação de odores.

Apesar do mecanismo de transporte de elétrons e redução do oxigênio ter sido razoavelmente bem determinado até os anos 50, permaneceu elusivo por um longo tempo qual seria a ligação entre este processo e a síntese de ATP mitocondrial. Em 1961, Mitchell propôs que não havia um intermediário químico rico em energia ligando os dois processos, mas que a síntese de ATP era fomentada pela energia contida no gradiente de prótons gerado a partir do transporte de elétrons. Este modelo quimiosmótico foi proposto inicialmente sem evidências experimentais claras de que havia realmente um gradiente transmembranar de prótons na mitocôndria ou que uma força protonmotriz fosse capaz de levar à síntese de ATP, levando-o a ser duramente criticado. Posteriormente, o modelo foi comprovado por vários estudos distintos.

No modelo quiomiosmótico, os prótons extruídos da mitocôndria pelo transporte de elétrons criam um gradiente através da membrana mitocondrial interna composto por duas grandezas: uma diferença de pH e uma diferença de cargas. Como há potentes sistemas tampão operando nestes ambientes, e vários ânions tamponantes como o fosfato são permeáveis à membrana interna, o gradiente de cargas é o componente mais importante. Como resultado do gradiente transmembranar de prótons, há uma força protonmotriz, que torna a re-entrada do próton para a mitocôndria altamente favorável. Em mitocôndrias em condições fisiológicas, esta reentrada é realizada através da ATP sintase, e é acoplada à síntese de ATP.

A maior evidência da veracidade do modelo quimiosmótico veio do grupo do Jangendorf, trabalhando com cloroplastos, que foi capaz de mostrar que somente a existência de um gradiente transmembranar de pH era capaz de levar à síntese de ATP.

O modelo quimiosmótico explica porque compostos hidrofóbicos capazes de dissociar prótons como o dinitrofenol e FCCP são capazes de promover transporte de elétrons na ausência de síntese de ATP. Este desacoplamento entre os dois processos ocorre por causa da característica destes compostos agirem como ionóforos de prótons, dissociando o gradiente transmembranar de prótons e estimulando o transporte de elétrons.

Existem proteínas ubíquas que exercem uma função parecida com a destes compostos desacopladores, as proteínas desacopladoras. Estas proteínas permitem a entrada de prótons de modo dependente da presença de ácidos graxos. Elas possuem função termogênica, regulam a geração mitocondrial de espécies reativas de oxigênio e participam do controle do peso corporal.

O acoplamento do retorno do próton à matriz mitocondrial e a síntese de ATP dependem da passagem do próton pela porção FO (sensível a oligomicina) da ATP sintase, que consiste em um canal transmembranar. Esta porção está ligada a uma porção globular na matriz, a porção F1, isolada inicialmente por Racker, que isoladamente tem atividade ATPásica.

A F1 ATP sintase é capaz de promover um microambiente em que a síntese e hidrólise de ATP são igualmente favoráveis através da ligação forte com o ATP, que compensa a liberação energética de sua hidrólise. O desligamento do ATP da ATP sintase é proporcionado pela passagem do próton pela FO, alterando a conformação espacial. A F1 possui três subunidades que se alternam entre as conformações que ligam ADP + Pi, que propiciam a formação de ATP e que propiciam seu desligamento, conforme prótons passam e alteram a conformação do eixo central da proteína. Este modelo com três sítios ativos foi proposto por Boyer, e evidenciado pela resolução da estrutura tridimensional da proteína por Walker. A estrutura da ATP sintase inclui três subunidades em sua porção matricial (F1) que se organizam em torno de um eixo conectado à FO. A rotação mecânica deste eixo promovida pela força protonmotriz altera a conformação das diferentes subunidades de F1.

Evidência experimental para a rotação do eixo central da ATP sintase foi obtida em 1999 pelo grupo de Futai, que ligou a ATP sintase a filamentos de actina marcados, e observou sua rotação acoplada à hidrólise de ATP. Em 2004, o grupo de Itoh demonstrou experimentalmente que a rotação deste eixo era suficiente para promover a síntese de ATP na ausência de um gradiente de prótons, forçando a rotação através de campos magnéticos e a ligação do eixo a beads metálicos.

Além de promover a síntese de ATP, o gradiente de prótons transmembranar também promove o transporte de ADP e Pi para o interior da organela, e K+ para fora. Pi é co-transportado com um próton pela fosfato translocase, a favor do gradiente quimiosmótico. K+ é trocado por um próton pelo antiporter K+/H+, também a favor do gradiente transmembranar. ADP é trocado por ATP, com uma carga negativa a mais, pelo translocador de nucleotídeos de adenina, a favor do gradiente de cargas transmembranar.

O transporte de elétrons e fosforilação oxidativa é regulado principalmente pela abundância de doadores de elétrons (NADH e FADH2), O2, ADP e Pi. Na ausência de altos níveis de ATP, há diminuição da reentrada de prótons, aumento do potencial de membrana e diminuição da velocidade de consumo de O2 e NADH. Baixos níveis de ATP têm o efeito contrário. Proteínas desacopladoras e canais de K+ podem estimular a respiração mesmo na ausência de fosforilação oxidativa. O óxido nítrico, possivelmente proveniente da óxido nítrico sintase mitocondrial, é também um regulador endógeno importante da velocidade de transporte de elétrons. A regulação da velocidade de transporte de elétrons pode ter uma importância grande para o balanço redox intracelular, pois a cadeia respiratória é uma fonte substancial de espécies reativas de oxigênio, e mantê-la altamente reduzida, como ocorre quando há baixo transporte de elétrons, pode propiciar à formação destas espécies.